研究背景：

細胞不斷感知和響應(yīng)微環(huán)境中的生化和生物力學變化重要作用，需要動態(tài)代謝適應(yīng)保供。細胞外基質(zhì)（ECM）硬化是癌癥侵襲性的標志品率，而基質(zhì)剝離下的生存也與不良預后相關(guān)共享應用。細胞通過整合素共軛結(jié)合的焦點附著斑（FAs） 感知ECM的物理特性深入實施，影響細胞遷移保持穩定、分化和存活推進高水平。由于組織纖維化和ECM硬化與腫瘤預后不良相關(guān)長效機製，通過膠原蛋白消耗或賴氨酸氧化酶（LOX）抑制或藥物改變細胞機械轉(zhuǎn)導來抑制ECM硬化已成為癌癥治療的有希望的選擇交流。腫瘤細胞如何在堅硬的基質(zhì)上獲得生長優(yōu)勢基礎，而在基質(zhì)脫離時抵抗失巢凋亡死亡仍然是一個謎，其作用機制仍不清楚還不大。

失巢凋亡是一種特殊形式的程序性細胞死亡高產。正常貼壁生長的細胞在失去與細胞外基質(zhì)（ECM）的黏附或細胞間相互接觸受到破壞后，因無法從周圍環(huán)境中獲得生存信號而啟動的一種細胞凋亡程序發揮作用。腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移是一個復雜的多步驟過程良好，其中包括腫瘤細胞從原發(fā)腫瘤組織脫離、侵入周圍組織銘記囑托、進入血液循環(huán)或淋巴循環(huán)引領、在遠處器官黏附和定植等環(huán)節(jié)。失巢凋亡在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起著重要的屏障作用示範。正常情況下應用前景，脫離原發(fā)腫瘤組織的腫瘤細胞由于失去了與細胞外基質(zhì)的黏附，應(yīng)該發(fā)生失巢凋亡而死亡運行好，從而限制了腫瘤細胞的擴散首次。然而可能性更大，腫瘤細胞往往通過多種方式逃避失巢凋亡，這使得其能夠在血液循環(huán)中存活并轉(zhuǎn)移到遠端器官搖籃，形成轉(zhuǎn)移灶技術。

在本研究中，研究人員詳細介紹了整合素/GSK3 β/FTO/MTOR軸在乳腺癌進展中的作用：乳腺癌細胞通過該信號軸整合剛度感知推動，以確保剛性基質(zhì)賦予的生長優(yōu)勢和基質(zhì)剝離下細胞的抗失巢凋亡能力技術研究。

圖1 作用模式圖

研究結(jié)果：

1. 基質(zhì)硬化激活mTORC1通路，促進細胞生長

研究的結(jié)果表明開展研究，在剛性培養(yǎng)條件下姿勢，使用mTORC1抑制劑雷帕霉素和/或肌球蛋白II抑制劑blebbistatin抑制細胞收縮力后，細胞生長顯著降低首要任務。RNA-Seq的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)在硬基質(zhì)培養(yǎng)條件下的上調(diào)特征基因富集在mTORC1信號通路綠色化。此外，與軟基質(zhì)相比形式，多種細胞在硬基質(zhì)條件下的phos-S6水平顯著增加建設應用，而總S6水平?jīng)]有明顯變化。同時日漸深入，AKT和AMPKα磷酸化水平無顯著差異動力，這表明mTORC1在硬化條件下激活的特異性。

圖2 硬基質(zhì)培養(yǎng)條件下mTORC1激活介導細胞生長

2. mTORC1在硬基質(zhì)上的激活受基于整合素的FAs調(diào)控

為研究FAs是否參與底物剛度誘導的mTORC1激活互動式宣講，研究人員首先使用免疫熒光染色效高性，檢測到mTOR/Phos-S6與FA標記蛋白paxillin或vinculin在硬基質(zhì)而不是軟基質(zhì)上的強共定位。而使用blebbistatin干擾硬基質(zhì)培養(yǎng)細胞的細胞收縮性時自動化，共聚焦和超分辨率STED成像表明mTOR和phos-S6的特異性FA定位消失提升。表明FAs在硬基質(zhì)誘導的mTORC1激活中起關(guān)鍵作用。

圖3 mTORC1在硬基質(zhì)上的激活受基于整合素的FAs調(diào)控

此外不折不扣，mTOR蛋白質(zhì)水平和mTORC1活性的同時減低只在敲低??1整合蛋白時發(fā)生支撐能力。同時，整合素??1的敲低阻礙了mTOR/phos-S6和paxillin在硬基質(zhì)上的共定位高效利用，并降低了 mTORC1的活性特征更加明顯。這些結(jié)果揭示了整合素??1在基質(zhì)硬度介導的mTORC1激活中的重要作用。

3. 軟基質(zhì)通過調(diào)節(jié)m6A RNA甲基化降低mTOR蛋白豐度

進一步的研究發(fā)現(xiàn)軟基質(zhì)上的細胞或敲低黏著斑蛋白顯著降低mTOR蛋白水平講理論，而Raptor的可能性、mLST8或DEPDC6豐度無變化。MG132在對照組中導致mTOR蛋白的積累市場開拓。而在blebbistatin處理的細胞中措施，這種增加被減弱；這暗示在低收縮力下，mTOR蛋白的合成可能受到阻礙緊密相關，導致總mTOR降低更默契了，而兩組間mTOR降解無明顯差異。表明在軟基質(zhì)下mTOR水平的下降,收縮力的降低是由于蛋白合成受到抑制而非降解增強引起的培訓。

圖4 基質(zhì)剛性調(diào)節(jié)mTOR豐度和m6A水平

此外不合理波動，blebbistatin干預后mTOR mRNA減少，但熒光素酶報告基因檢測mTOR mRNA轉(zhuǎn)錄能力時重要工具，在blebbistatin干預后無顯著差異積極拓展新的領域。相比之下，使用放線菌素D阻斷 RNA合成并監(jiān)測 mRNA穩(wěn)定性時更優質， blebbistatin干預后 mTOR mRNA的降解速度明顯加快競爭力所在。使用SRAMP軟件在線預測了位于mTOR mRNA 3'UTR的5個非常高置信度的m6A修飾位點，在blebbistatin治療后領域，Me-RIP qPCR的結(jié)果顯示所有五個位點都表現(xiàn)出升高的m6A修飾溝通機製。這些數(shù)據(jù)表明剛性敏感的m6A變化可能介導mTOR蛋白豐度在不同剛度或細胞收縮性條件下的改變。

4. FTO磷酸化鏈接剛性傳感與mTOR m6A修飾

隨后註入新的動力，研究人員分析了甲基化酶/去甲基化酶METTL3領先水平、METTL14、WTAP雙重提升、VIRMA戰略布局、FTO和ALKBH5的干擾對硬基質(zhì)和軟基質(zhì)條件下mTOR和phos-S6蛋白變化的影響。發(fā)現(xiàn)FTO是參與mTOR m6A修飾的去甲基化酶表現明顯更佳。RIP-qPCR的結(jié)果表明狀態，blebbistatin處理的細胞中mTOR mRNA被FTO富集較對照組減少。表明mTOR mRNA和FTO之間的相互作用可能在低收縮性下被破壞穩定發展，留下更多的m6A修飾完整而沒有有效擦除基石之一。在不同硬度下，F(xiàn)TO的亞細胞定位和蛋白水平均未見明顯變化增持能力，而在blebbistatin處理的細胞中，F(xiàn)TO泛磷酸化絲氨酸水平升高行業內卷，進一步發(fā)現(xiàn)FTO的Ser 256位點磷酸化修飾是FTO調(diào)控mTORC1的關(guān)鍵追求卓越。

5. GSK3β定位在FA區(qū)域，磷酸化FTO激活mTORC1

人類FTO中的重復共識基序“256S/T- e - dd -S/T(P)260" 與GSK3的底物識別基序 “S/T- x - x - x -S/T(P)"相匹配參與能力。實驗表明合理需求，使用CHIR-98014 抑制GSK3β可降低FTO的磷酸化，而通過降低細胞張力激活FTO則會產(chǎn)生相反的效果充分發揮；同時發(fā)現(xiàn)CHIR-98014處理軟基質(zhì)培養(yǎng)的細胞后高質量，phos-S6水平恢復。此外，免疫共沉淀的結(jié)果表明管理，F(xiàn)TO與GSK3β存在直接結(jié)合設計。GSK3的亞細胞定位研究發(fā)現(xiàn)，GSK3在細胞質(zhì)中主要是彌漫性的改進措施，但在細胞的腹側(cè)顯示斑塊樣結(jié)構(gòu)就此掀開，與paxillin在FA位點共定位。

圖5 GSK3通過與整合素的相互作用今年，在磷酸化FTO中起著重要作用

而錳離子增加了GSK3的ser9上的磷酸化不斷豐富；同時，在硬底物與軟底物上培養(yǎng)的細胞中phos-GSK3 (Ser9)升高組建，但總GSK3水平?jīng)]有顯著變化各有優勢。這些結(jié)果確定了GSK3在基質(zhì)強度誘導的FTO和mTORC1激活中的潛在作用，以及其潛在機制可能涉及整合素??1重要的意義。

5. ECM脫離過程中mTORC1調(diào)節(jié)細胞自噬的作用機制

ECM脫離快速增長，相當于一個極其柔軟的基質(zhì)，已被報道誘導代謝應(yīng)激導致失巢凋亡占，自噬可以 保護細胞免受損傷高質量，促進與ECM的再附著，研究在低黏附基質(zhì)上培養(yǎng)MDA-MB-231和MEF細胞時激發創作，觀察到LC3B-II水平升高和mTOR及phos-S6水平下降前景。表明了自噬水平的升高。

圖6 基質(zhì)剛性通過mTORC1信號調(diào)控自噬

隨后增幅最大，懸浮MEF較貼壁細胞碘化丙啶（PI）染色率共享應用，而自噬藥理抑制劑氯喹（CQ）的干預進一步增強了細胞死亡程度。在雷帕霉素處理的細胞中標準，細胞死亡的增強明顯減弱示範推廣。通過血清刺激激活mTORC1后，也觀察到CQ治療對細胞死亡的類似影響即將展開。表明基質(zhì)分離能夠通過抑制mTORC1活性增強自噬大幅增加，從而促進細胞對失巢凋亡的抵抗并提高生存率。此外傳承，在多個腫瘤細胞系中觀察到等特點，LC3B-II蛋白在硬底物或高收縮力的細胞中減少，而在軟底物或低收縮力的細胞中增加多種；且TEM觀察到低收縮性細胞中自噬體數(shù)量增加將進一步，提示軟基質(zhì)上自噬通量增強。另外發展成就，TSC2敲除細胞中硬基質(zhì)與軟基質(zhì)上LC3B-II水平的差異減弱成就。這表明基質(zhì)硬化以mTORC1依賴的方式阻礙自噬重要方式。最后，在DCIS患者連續(xù)切片組織樣本中系統，與正常乳腺上皮相比非常重要，分離細胞和腔細胞的LC3B水平更高，而分離細胞和腔細胞中相應(yīng)的mTOR 水平與LC3B呈反相關(guān)互動互補。

綜上所述發揮重要帶動作用，研究結(jié)果強調(diào)了細胞代謝的雙相機制調(diào)節(jié)，與腫瘤在纖維化等硬化條件下的生長以及癌癥轉(zhuǎn)移期間的失巢凋亡抗性有關(guān)意料之外∥幕瘍r值；|(zhì)硬化時可以通過整合素和GSK3β-FTO介導的mRNA m6A修飾激活mTORC1，提高mTOR水平置之不顧，促進合成代謝不斷完善；在ECM脫離時抑制該軸增強自噬，進而抑制失巢凋亡促進細胞存活方便。

文獻給讀者的啟發(fā)在于揭示剛性感知在腫瘤進展中的作用基礎上，一方面揭示實體瘤細胞生長中的新機制；另一方面揭示腫瘤轉(zhuǎn)移過程中脫離基質(zhì)后應用領域，腫瘤細胞通過自噬抵抗失巢凋亡促進存活的生存策略保持競爭優勢。這種腫瘤細胞對基質(zhì)微環(huán)境的應(yīng)答機制有助于對腫瘤進展的理解和靶向治療的開發(fā)。