實驗原理

干細胞成球?qū)嶒?sphere-formation assay)是一種基于非貼壁依賴培養(yǎng)條件的干細胞篩選技術(shù)
提單產。在無血清但富含特定細胞因子的培養(yǎng)環(huán)境中，具有干性的細胞能夠聚集成團形成三維球體結(jié)構(gòu)，而普通分化細胞則因缺乏貼壁條件而凋亡
。這種球體結(jié)構(gòu)能模擬體內(nèi)干細胞微環(huán)境優勢，是評估細胞自我更新能力的金標準。

實驗材料

• ?細胞樣本?：對數(shù)生長期干細胞(推薦60-80%融合度)
  

• ?特殊耗材?：

• 超低吸附培養(yǎng)板(6/12/24孔)
  

• 細胞篩(70μm孔徑)
  

• ?培養(yǎng)基組分?：

• 基礎(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM/F12或1640)
  

• B27營養(yǎng)液(50X)
  

• 重組生長因子(EGF 10ng/mL, bFGF 10ng/mL)
  

• 胰島素(5μg/mL)
  

實驗步驟

一次成球培養(yǎng)

1. 消化收集細胞基礎，PBS清洗2次去除血清
   

2. 細胞計數(shù)后提供堅實支撐，以1000個細胞/孔密度接種于超低吸附6孔板
   

3. 加入無血清成球培養(yǎng)基(含EGF+bFGF)
   

4. 37℃、5% CO?培養(yǎng)7-10天
   

二次成球驗證

1. 70μm細胞篩過濾收集原代球體
   

2. 消化成單細胞懸液高產，PBS重懸
   

3. 按相同條件進行二次培養(yǎng)
   

4. 計算球體形成效率(SFE)=球體數(shù)/接種細胞數(shù)×100%
   

關(guān)鍵參數(shù)

• ?接種密度?：500-2000個細胞/孔(密度過高易導致球體融合)
  

• ?培養(yǎng)周期?：7-14天(定期鏡下觀察球體形態(tài))
  

• ?鑒定標準?：

• 直徑>50μm的球體計為有效克隆
  

• 連續(xù)傳代3次仍保持成球能力
  

應(yīng)用領(lǐng)域

• ?腫瘤干細胞研究?：富集CD44+/CD133+腫瘤起始細胞
  

• ?藥物篩選?：評估靶向干細胞藥物的效果
  

• ?衰老研究?：檢測脂肪祖細胞(APCs)的年齡相關(guān)活化

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