常用檢測方法

1. 熒光探針法

• ?原理?：使用鈣離子敏感熒光探針(如Fluo-3統籌推進、Fluo-4)與Ca2?結(jié)合后產(chǎn)生熒光信號變化
  

• ?操作流程?：

1. 探針負載：將細胞與熒光探針共孵育(通常30-60分鐘)
   

2. 洗滌去除多余探針
   

3. 實時監(jiān)測熒光強度變化(激發(fā)/發(fā)射波長約488/525nm)
   

• ?優(yōu)勢?：靈敏度高方案、可實時動態(tài)監(jiān)測
  

2. 流式細胞術(shù)

• ?應(yīng)用?：高通量分析群體細胞Ca2?濃度分布
  

• ?特點?：

• 結(jié)合熒光探針使用
  

• 可同時檢測其他參數(shù)(如細胞周期)
  

3. 共聚焦顯微鏡技術(shù)

• ?優(yōu)勢?：亞細胞分辨率，可定位Ca2?信號空間分布
  

• ?應(yīng)用?：研究局部鈣信號(如突觸小體鈣震蕩)
  

實驗設(shè)計要點

樣本制備

• ?細胞狀態(tài)?：建議使用對數(shù)生長期細胞(70-80%融合度)
  

• ?對照設(shè)置?：

• 陰性對照(無探針組)
  

• 陽性對照(鈣離子載體處理組)
  

參數(shù)優(yōu)化

• ?探針濃度?：避免過度負載導(dǎo)致的細胞毒性
  

• ?檢測時間?：根據(jù)信號動態(tài)范圍確定(通常5-30分鐘)
  

• ?溫度控制?：維持37℃恒溫環(huán)境
  

數(shù)據(jù)分析

信號處理

• ?基線校正?：扣除背景熒光
  

• ?標準化表達?：ΔF/F?=(F-F?)/F?
  

• ?動力學(xué)參數(shù)?：

• 峰值幅度

• 上升/下降時間常數(shù)
  

注意事項

1. ?避光操作?：熒光探針易光漂白
   

2. ?鈣緩沖系統(tǒng)?：控制胞外Ca2?濃度
   

3. ?多參數(shù)驗證?：建議結(jié)合電生理或分子生物學(xué)方法
   

4. ?設(shè)備校準?：定期進行熒光強度標定